Comparación de Métodos de Diagnósticos

PARA EL SARS-CoV-2

Introducción

Todos sabemos que tenemos una emergencia sanitaria a nivel mundial, sabemos que hay que tomar medidas para prevenir ser contagiados y contagiar de este virus, pero eso ya lo sabes. La información que vamos a brindarte en esta página web está más dirigida al diagnóstico de esta enfermedad, ¿Cómo es que se diagnostica?, ¿Existe sólo una prueba?, ¿Qué tan probable es que tenga un diagnóstico correcto?.

En algunas pruebas de diagnóstico se usan algo llamados marcadores, los marcadores son moléculas biológicas que se encuentran en la sangre, otros líquidos o tejidos del cuerpo y son signos de un proceso normal o anormal, o de una afección o enfermedad. Existen dos tipos de diferentes marcadores que son: marcadores que detectan la presencia actual del virus en el organismo, class="lead"es decir, nos sugiere que existe una infección activa y los marcadores que detectan la presencia de anticuerpos tras el contacto con el virus.

El Covid-19 se puede detector a través de dos tipos de pruebas diagnósticas (aprobadas): pruebas serológicas y pruebas rápidas; en estas pruebas encontramos distinta sensibilidad y especificidad.

Ante el avance de la epidemia actual, surge la necesidad de usar pruebas para diagnosticar el virus que sean altamente confiables, para que no repercutan de una manera negativa en la sociedad; para esto, es necesario realizar una prueba que idealmente diagnostique correctamente a toda la población sana y enferma.

PCR

La reacción en cadena de la polimerasa PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es un método que permite detectar un fragmento del material genético de un patógeno; fue inventada por Kary Mullis en 1986 y le valió el premio Nobel en 1993.

La prueba PCR logra la detección del material genético del coronavirus (ARN) de forma precoz en las primeras fases del proceso infeccioso, con independencia de que aún no haya síntomas o no los vaya a desarrollar, como en el caso de las personas asintomáticas.

Para la realización de esta prueba se necesita un ambiente est la recolección de una muestra de la porción nasal de la faringe (muestra nasofaríngea), y de la porción bucal de la faringe (muestra orofaríngea), estas serán recolectadas con un hisopo de rayón estéril, para que el procedimiento se realice correctamente es necesario que la muestra se tome en un ambiente estéril, para evitar la contaminación de la muestra.

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En este caso se lleva a cabo una variante de la PCR, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Reversa (RT-PCR); ya que la PCR necesita trabajar con ADN y la información del virus está en forma de ARN, este procedimiento consiste en retrotranscribir una hebra de ARN a ADN Complementario (ADNc) usando una enzima llamada Transcriptasa Reversa, y el resultado se amplifica mediante una PCR tradicional.

La PCR tradicional requiere la presencia de ADN molde (en nuestro caso es el ADNc obtenido en el proceso anterior), cebadores, nucleótidos y ADN polimerasa. El ADN polimerasa es la enzima clave, que utilizando el ADN molde hace una copia de este mediante la incorporación de nucleótidos de forma secuencial en el producto de la PCR. Los nucleótidos adenina, timina, citosina y guanina son los bloques de la nueva copia resultante. Los cebadores u oligonucleótidos son los que confieren especificidad a la reacción ya que son fragmentos cortos de ADN con una secuencia definida complementaria al ADN molde que quiere ser amplificado. La ADN polimerasa utiliza los cebadores como punto de inicio de la polimerización del nuevo fragmento de ADN.

Los componentes de la PCR se mezclan en un tubo de ensayo y luego se colocan en una máquina llamada termociclador que permite que se produzcan ciclos repetidos de amplificación de ADN, en la que existen tres etapas principales que se explicarán a continuación:

Desnutaralización:

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual.

Alineamiento o unión del cebador:

A continuación la temperatura se baja a 40-68 °C (según el caso) permitiendo así el alineamiento mediante puentes de hidrógeno de los cebadores específicos a los segmentos de ADN molde, los puentes de hidrógeno estables solo se forman cuando se usa el cebador específico para esa parte del ADN molde que queremos detectar y es única del virus, por lo que los cebadores no se unen a alguna otra parte del gen del ADN molde.

Extensión o elongación de la cadena:

La temperatura se eleva de nuevo hasta una temperatura en la cual el ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde, añadiendo los nucleótidos complementarios a la hebra de ADN que se está construyendo.

Con cada repetición de estos tres pasos, el número de moléculas de ADN copiadas se duplica. Tras 30-40 ciclos a partir de una única copia de ADN se pueden obtener más de mil millones de copias de un gen y en un tiempo record.

La electroforesis en gel de agarosa es el método más fácil de visualizar y analizar el producto de PCR. Permite la determinación de la presencia y el tamaño del producto de PCR mediante la tinción del producto de ADN amplificado con un tinte químico como el bromuro de etidio, que se intercala entre las dos hebras del dúplex. Así si hay una respuesta de florescencia significa que la persona esta contagiada y se puede conocer la cantidad de pares de bases finales, y si no hay florescencia significa que la persona no está infectada por el virus SARS-CoV-2.

Microcantilevers (MCL)

Los microcantilevers son un biosensor mediante el cual se detecta la presencia ya sea de anticuerpos formados por el cuerpo para combatir cierto antígeno, o la presencia del mismo antígeno mediante la detección de sus proteínas, este es un método de diagnóstico que aún está en investigación; vamos a hablar del estudio que se hizo para la detección de las proteínas ubicadas en la estructura del FIP (Coronavirus felino) muy parecido al SARS-CoV, y, que ventajas y desventajas tendría de ser posible su uso en el nuevo coronavirus frente al estándar de oro, el PCR, ya explicado anteriormente.

El microcantilever es un sensor de desplazamiento ideal. La capacidad de detectar el movimiento en una voladizo con precisión nanométrica hace que el cantilever sea ideal para medir la flexión. La flexión en cantilever puede estar relacionada con la adsorción / desorción de moléculas a través de fuerzas de adsorción. Como las reacciones moleculares en una superficie son impulsadas en última instancia por energía libre.

Los microcantilevers son dispositivos extremadamente sensibles para medir cantidades diminutas de masa. La detección se realiza detectando un cambio en la frecuencia de oscilación. La presencia de una gota en un cantilever crea una pequeña flexión hacia abajo de la viga debido al peso de la gota y una deflexión hacia arriba provocada por la componente vertical de las fuerzas capilares a lo largo de la línea triple.

En el experimento se usaron microcantilevers de silicio disponibles comercialmente. Las dimensiones de los microcantilevers de silicio en forma de V eran de 180 um de longitud, 24 um de ancho de plata y 1 um de grosor, un lado de estos cantilevers se cubrió con una fina película de cromo (3 nm), seguido de una capa de oro de 20 nm.

El cantilever se trató químicamente para que los anticuerpos de adhieran a la superficie, para así detectar a las proteínas estructurales del SARS-CoV.

En la realización del procedimiento se creó una placa de vidrio con un circuito que permitía el paso de una solución del virus, se ingresó el microcantilever en el circuito y después se introdujo un suero sin el antígeno (FIP), al hacer esto no se detectó deflexión en el cantilever. Después se agregó el suero con el antígeno, y al cabo de 60 min se notó un cambio notable de deflexión hacia abajo, detectada por el chip microcantilever, lo que indicaba que el cantilever funcionaba, se hicieron más pruebas con diferentes caudales, teniendo un control negativo y uno positivo, y se concluyó que cuando el caudal es más bajo se detecta una mayor amplitud de flexión, que cuando el caudal era alto, lo que nos indicaba que las partículas de coronavirus (FIP) necesitaban tiempo para orientarse y adherirse de manera adecuada a los anticuerpos, y, que la adherencia se ve completamente afectada por las condiciones ambientales, como la tasa de flujo. Sería necesario un tiempo de reacción de 45 a 60 min para saturar la unión, en un caudal más bajo y se necesitó más tiempo para alcanzar el equilibrio en un caudal más alto.

En la siguiente gráfica se muestra la amplitud de deflexión del microcantilever era proporcionales a las concentraciones de FIP inyectado. El error estuvo dentro del 15%. Muestra que el micro cantilever se puede utilizar para la detección de FIP con un límite de detección de FIP con un límite de detección de 0,1 ug/ml-1, cuando el tiempo de ensayo fue <1h. El límite de detección fue similar al de ELISA en un tiempo relativamente más corto.

Este trabajo tuvo como objetivo validar el enfoque del sensor de microcantilever para la detección de coronavirus felino en solución. El sensor puede detectar una concentración viral tan baja como 0,1 µg ml.

Ahora contemplando que se pudiera usar para el SARS-CoV-2. Analizando lo anterior, sería una buena alternativa al PCR, no siendo la mejor opción, pero si usable, esto no significa que se vaya a vender inmediatamente se cree el modelo funcional, porque antes de que llegue al mercado tendría que ser evaluada por organizaciones como la FDA o la COFEPRIS, en caso de ser evaluada por la FDA, si se creara un modelo funcional durante el estado de emergencia, se eviaría al mercado, pero no sin saber que no puede afectar a nadie obviamente, esto significa que habría una evaluación que no sea igual de rigurosa que una evaluación normal para la aprobación de este tipo de dispositivos médicos, pero si una evaluación funcional y objetiva, esto no significa que no vaya a servir, pero por estado de emergencia habría que actuar rápido. Y al terminar el estado de emergencia se sometería a la evaluación normal, para continuar con su venta en el mercado. Ya sabiendo esto podemos comparar los dos métodos de diagnóstico ya estudiados.

Ventajas y Desventajas de cada Método

Principales Ventajas del PCR

  • Porcentaje del 99% de especifidad
  • Porcentaje del 99% de sensibilidad
  • No necesita una alta concentración viral

Principales Ventajas del PCR

  • Alto coste
  • Puede tardar horas en obtener resultados

Principales Ventajas de los MCL

  • Bajo Coste
  • Tarda máximo 1 hora

Principales Ventajas de los MCL

  • Necesita mayor concentración viral que el PCR
  • Probabilidad del 15% de error (sin especificar sensibilidad y especifidad)

Conclusión

Ahora que ya sabemos como funciona cada método de diagnóstico, y, sus ventajas y desventajas, con esto podemos decir que, la PCR por su gran precisión en diagnosticar a una persona de la manera correcta sigue siendo el estándar de Oro, pero eso no lo hace el método de diagnóstico más viable para ser usado en una pandemia como la que vivimos actualmente, pues este es costoso lo que limita el número de pruebas que pueden ser realizadas, y, eso hace más difícil que la oferta de las pruebas de PCR cubra la demanda. Ahí es donde entran los Microcantilevers que a pesar de no ser una prueba que actualmente se pueda usar en el diagnóstico del SARS-CoV-2, si se lograr adaptar al este virus, y, pasara las pruebas correspondientes para su lanzamiento al mercado, por todas sus características sería una muy buena alternativa al PCR (no un sustituto), debido a su bajo coste, el poco tiempo que necesita para que se puedan tener resultados y la mayor facilidad de operación ya teniendo el dispositivo aun así los Microcantilevers necesitarían mejoras para que sean viables, como una mayor sensibilidad a la concentración viral, y disminuir ese margen de error. Así que podríamos decir que sería una muy buena opción, para usarla en el diagnóstico de SARS-CoV-2.

Para, concluir espero que hayas aprendido como funcionan estos métodos de diagnóstico, como son evaluados, las características que hay que tomar en cuenta para que puedan ser una buena opción. Y que también te decidas a investigar más, porque aquí sólo te presentamos dos métodos, pero, hay muchos otros que son aplicados o podrían ser aplicados para el diagnóstico de SARS-CoV-2.

Esperamos que te haya gustado el contenido de esta página web hecha por el equipo D-05 del CdeCMX Challenge 2020.

Fuentes